单细胞/pseudobulk差异分析

用途与运行方式

1. 单细胞水平差异分析（无生物学重复）

支持t-test、wilcoxon、MAST

• 场景一：指定类别1与类别2差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon  \
  --ident1 1 --ident2 2 \
  --fdr 0.05 --log2fc 1
  

• 场景二：每个类别与其余类别分别做差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon \
   --fdr 0.05 --log2fc 1
  

• 场景三：对obs的某列做子集后再差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon \ 
  --ident1 1 --ident2 2 \
  --fdr 0.05 --log2fc 1 \
  --subset_key cell_type --subset_values B
  

2. pseudobulk差异分析（有生物学重复）

推荐DESeq2、edgeR（pseudobulk分析），需指定--sample_key，且每组样本数需满足方法要求（DESeq2≥3，edgeR≥2）

• 场景一：两组样本直接差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key sampleID --de_method DESeq2 \ 
  --ident1 Tumor --ident2 Normal \
  --fdr 0.05 --log2fc 1 \
  --sample_key sampleID
  

• 场景二：子集后做pseudobulk差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key sampleID --de_method DESeq2 \ 
  --ident1 Tumor --ident2 Normal \
  --fdr 0.05 --log2fc 1 \
  --sample_key sampleID \
  --subset_key cell_type --subset_values B
  

输入参数说明

输出结果展示

• raw文件格式示例：de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.raw.csv 这个文件是差异分析软件生成的分析结果，里面可能包含除了基因名、差异倍数、Pvalue、adjusted Pvalue（FDR）等信息外的其他信息。

• all/sig_filtered文件格式示例：de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.all.csv 文件是从差异分析软件生成的分析结果中提取了基因名、差异倍数、Pvalue、adjusted Pvalue（FDR）重新统一命名后的结果文件，de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.sig_filtered.csv文件是根据log2FC和FDR阈值进行筛选后得到的显著差异基因列表。

• 火山图结果示例: de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.png/pdf 图中红色的点表示同时达到log2FC和FDR筛选阈值的显著差异基因，蓝色的点表示达到FDR筛选条件但没达到log2FC条件的基因，绿色的点表示达到log2FC筛选条件但没达到FDR条件的基因，同时，默认会在图中标出差异倍数最高和最低的5个基因，如果需要在图中标注指定的基因，可以通过genelist参数进行指定(例如， --genelist geneA,geneB,geneC)。

结果解读说明

1. 基因名唯一化
   • 差异分析前会自动对基因名进行make_unique，所有输出和作图均使用唯一化后的基因名。

2. 细胞和基因过滤

   • 支持通过--min_gene、--max_gene、--min_cell等参数对细胞和基因进行过滤。若h5ad已过滤，可不再设置。

调参建议

1. 超过200k的bin/cell数据量时MAST无法成功运行，这种情况下可以通过设置更严格的过滤参数（min_gene和min_cell）减少bin/cell的数量再进行分析。